डीएनए खंड का पृथक्करण और विलगन

डीएनए खंडों को अलग करने की प्रक्रिया को जेल इलेक्ट्रोफ़ोरेसिस (gel electrophoresis) कहते हैं। इस प्रक्रिया में, डीएनए को छोटे-छोटे खंडों में काटा जाता है और फिर इन्हें विद्युत क्षेत्र में ऐनोड की तरफ़ भेजा जाता है। डीएनए खंड ऋणात्मक आवेशित होते हैं, इसलिए इन्हें अलग करने के लिए ऐगारोज जैल का इस्तेमाल किया जाता है। ऐगारोज जेल के छलनी प्रभाव से डीएनए खंडों को उनके आकार के हिसाब से अलग किया जाता है।

• डीएनए खंडों को अलग करने के लिए, प्रतिबंधन एंडोन्यूक्लिएज़ (restriction endonuclease) नामक एंजाइम का इस्तेमाल किया जाता है।
• डीएनए खंडों को अलग करने के बाद, इन्हें इथीडियम ब्रोमाइड नामक यौगिक से अभिरंजित करके देखा जाता है।
• इथीडियम ब्रोमाइड एक स्फुरदीप्त (Fluorescent) अभिरंजक है।
• पराबैंगनी (Ultraviolet) रोशनी में इथीडियम ब्रोमाइड से अभिरंजित डीएनए खंड चमकीले नारंगी रंग में दिखाई देते हैं।
• डीएनए की पृथक्कृत पट्टियों को ऐगारोज जेल के टुकड़ों से निकालने की प्रक्रिया को क्षालन (elution) कहते हैं।

प्रतिबंधन एंडोन्यूक्लिएज़

प्रतिबंध एंजाइम, जिन्हें प्रतिबंध एंडोन्यूक्लिएज के रूप में भी जाना जाता है, वे प्रोटीन होते हैं जो विशिष्ट अनुक्रमों पर डीएनए को काटते हैं, आणविक जीव विज्ञान, आनुवंशिकी और जैव प्रौद्योगिकी में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं। प्रतिबंध एंजाइम आणविक जीव विज्ञान और जैव प्रौद्योगिकी में महत्वपूर्ण उपकरण हैं, जो वैज्ञानिकों को अनुसंधान, चिकित्सा और कृषि उद्देश्यों के लिए डीएनए में हेरफेर करने में सक्षम बनाते हैं। विशिष्ट अनुक्रमों पर डीएनए को काटने की उनकी क्षमता आनुवंशिक इंजीनियरिंग और कई आधुनिक जैविक तकनीकों के लिए मौलिक है।

प्रतिबंध एंजाइम ऐसे एंजाइम होते हैं जो डीएनए में न्यूक्लियोटाइड के विशिष्ट छोटे अनुक्रमों को पहचानते हैं और इन साइटों पर या उनके आस-पास डीएनए को काटते हैं। वे स्वाभाविक रूप से बैक्टीरिया और आर्किया में पाए जाते हैं, जहाँ वे आक्रमणकारी वायरल डीएनए (बैक्टीरियोफेज) के खिलाफ़ रक्षा तंत्र के रूप में काम करते हैं।

प्रतिबंध एंजाइमों के प्रकार

• प्रकार I: ये एंजाइम डीएनए को उनके पहचान स्थलों से दूर यादृच्छिक स्थानों पर काटते हैं। उन्हें गतिविधि के लिए एटीपी की आवश्यकता होती है और उनमें प्रतिबंध और संशोधन दोनों कार्य होते हैं।
• प्रकार II: प्रयोगशाला अनुप्रयोगों में सबसे अधिक उपयोग किए जाने वाले, प्रकार II एंजाइम डीएनए को उनके पहचान अनुक्रमों के भीतर या उनके आस-पास विशिष्ट साइटों पर काटते हैं, अक्सर परिभाषित टुकड़े बनाते हैं। उन्हें एटीपी की आवश्यकता नहीं होती है और केवल प्रतिबंध कार्य होते हैं।
• प्रकार III: ये एंजाइम डीएनए को उनकी पहचान साइटों से थोड़ी दूरी पर काटते हैं और गतिविधि के लिए एटीपी की आवश्यकता होती है। उनके पास प्रतिबंध और संशोधन दोनों कार्य भी होते हैं।

पहचान अनुक्रम

पैलिंड्रोमिक अनुक्रम: कई प्रतिबंध एंजाइम पैलिंड्रोमिक अनुक्रमों को पहचानते हैं (एक ही अनुक्रम आगे और पीछे एक ही पढ़ता है)। उदाहरण के लिए, EcoRI के लिए पहचान साइट है:

EcoRI: 5' - GAATTC - 3'

3' - CTTAAG - 5'

काटने के पैटर्न

• कुछ प्रतिबंध एंजाइम दोनों डीएनए स्ट्रैंड को सीधा काटते हैं, जिससे कुंद सिरे बनते हैं। उदाहरण: SmaI.
• अन्य कंपित कट बनाते हैं, जिसके परिणामस्वरूप चिपचिपे या लटकते हुए सिरे बनते हैं जो पूरक डीएनए टुकड़ों के साथ आसानी से जुड़ सकते हैं। उदाहरण: EcoRI.

प्रतिबंध एंजाइमों के अनुप्रयोग

• आणविक क्लोनिंग: इनका उपयोग डीएनए टुकड़ों को काटने और जोड़ने के लिए किया जाता है, जिससे वैज्ञानिकों को रुचि के जीन को प्लास्मिड में क्लोन करने की अनुमति मिलती है।
• डीएनए फिंगरप्रिंटिंग: प्रतिबंध एंजाइमों का उपयोग आनुवंशिक पहचान के लिए प्रतिबंध खंड लंबाई बहुरूपता (आरएफएलपी) विश्लेषण जैसी तकनीकों में किया जाता है।
• जेनेटिक इंजीनियरिंग: वे ट्रांसजेनिक जीव विकास में जीन के हेरफेर की सुविधा प्रदान करते हैं।
• पीसीआर और जीन मैपिंग: पॉलीमरेज़ चेन रिएक्शन (पीसीआर) से उत्पन्न डीएनए टुकड़ों का विश्लेषण करने और आनुवंशिक मानचित्र बनाने के लिए उपयोग किया जाता है।

प्रतिबंध एंजाइमों का उपयोग करने की प्रक्रिया

• डीएनए तैयार करना: उस डीएनए को अलग करें जिसे काटने की आवश्यकता है।
• पाचन: विशिष्ट परिस्थितियों (तापमान, बफर, समय) के तहत प्रतिबंध एंजाइम के साथ डीएनए को इनक्यूबेट करें।
• विश्लेषण: डीएनए टुकड़ों के आकार को देखने के लिए जेल वैद्युतकणसंचलन जैसी तकनीकों का उपयोग करके परिणामी टुकड़ों का विश्लेषण करें।

जैव प्रौद्योगिकी में महत्व

जीन थेरेपी: प्रतिबंध एंजाइम आनुवंशिक रोगों के लिए चिकित्सीय तकनीकों को विकसित करने में भूमिका निभाते हैं।

सिंथेटिक बायोलॉजी: वे विभिन्न अनुप्रयोगों के लिए नई जैविक प्रणालियों और जीवों को डिजाइन करने में आवश्यक हैं।

अभ्यास प्रश्न

• प्रतिबंध एंजाइम क्या हैं, और आणविक जीव विज्ञान में उनकी क्या भूमिका है?
• प्रतिबंध एंजाइम विशिष्ट डीएनए अनुक्रमों को कैसे पहचानते हैं?
• प्रतिबंध एंजाइमों के संदर्भ में पैलिंड्रोमिक अनुक्रमों का क्या महत्व है?
• प्रकार और वर्गीकरण प्रतिबंध एंजाइमों के विभिन्न प्रकार क्या हैं, और वे एक दूसरे से कैसे भिन्न हैं?
• प्रकार I, प्रकार II और प्रकार III प्रतिबंध एंजाइमों की मुख्य विशेषताएँ क्या हैं?
• प्रसिद्ध प्रतिबंध एंजाइमों और उनकी पहचान साइटों के उदाहरण दें।
• क्रिया का तंत्र प्रतिबंध एंजाइम डीएनए को कैसे काटते हैं? प्रक्रिया का वर्णन करें।
• प्रतिबंध एंजाइमों द्वारा उत्पादित कुंद सिरों और चिपचिपे सिरों के बीच क्या अंतर हैं?

• प्रतिबंध एंजाइम का चुनाव डीएनए क्लोनिंग के परिणामों को कैसे प्रभावित करता है?